Ambiente de cultivo: sustratos, fase gaseosa, medios de cultivo y propiedades físicas

    La influencia del ambiente de cultivo sobre las células es ejercida por cuatro vías principales: (i) naturaleza del sustrato o fase sobre o dentro de la que crecen las células, (ii) constitución fisicoquímica y fisiológica del medio de cultivo, (iii) constitución de la fase gaseosa, y (iv) propiedades físicas como la temperatura de incubación.

(i) Sustrato.

La mayoría de las células que han sido crecidas en cultivo, han sido cultivadas en mono capa sobre sustratos artificiales, y el crecimiento en suspensión sólo ha sido posible para ciertos tipos celulares como las células hematopoyéticas y otros pocos tipos. Es sabido ya que la mayoría de las células necesitan adherirse y extenderse sobre el sustrato para poder dividirse, con lo cual una correcta adherencia al sustrato resulta fundamental. Actualmente, las placas de cultivo de polietileno descartables proveen al investigador de una superficie de cultivo simple y reproducible para el cultivo, combinado con buenas propiedades ópticas.

Otro sustrato muy utilizado, aunque con fines específicos, son las bolitas de polietileno, sephadex, o poliacrilamida, para la propagación de células anclaje-dependientes en suspensión, amplificando así enormemente la superficie real de cultivo de un recipiente, como por ejemplo en el caso de los bio-reactores.

Las superficies son muy a menudo pre tratadas con por ejemplo medio de cultivo ya utilizado para el cultivo de otras células, o sembrando células que luego se remueven dejando sus secreciones adheridas, proveyendo de esta forma alguna de los constituyentes normales de la matriz extracelular del animal entero. También se agregan directamente a las placas, previo al contacto con las células, diversas macromoléculas de este tipo tales como laminina, fibronectina, colágeno, etc. En muchos casos in vitro, el contacto de la célula con estas macromoléculas es fundamental para un correcto crecimiento y expresión de sus características especializadas.

También se utiliza una mono-capa de células como acondicionadora del ambiente y como sustrato vivo para el cultivo de otro tipo celular. Este método no solo mejora o en algunos casos posibilita el crecimiento y diferenciación de ciertos tipos celulares en cultivo, sino que también contribuye a emular las condiciones originales de ciertos tejidos.

Se han diseñado otros muchos sistemas de cultivo para requerimientos especiales de determinado tipo celular, o condición experimental, tal es el caso de un tipo de recipiente que posee micro-capilares permeables, sobre los cuales se cultivan las células, y por dentro de los cuales se hace circular medio de cultivo.

(ii) Fase gaseosa.

Los constituyentes más importantes de esta fase para el cultivo de células son el O2 y el CO2. Los cultivos varían en sus requerimientos de oxígeno, tal es el caso de los cultivos celulares y los cultivos órgano-típicos. Mientras que tensiones de O2 atmosféricas o menores son preferibles para la mayoría de los cultivos de células, algunos cultivos órgano-típicos requieren hasta un 95% de O2 debido a su escasa difusión.

El CO2 tiene un papel complejo, y es difícil entender cómo ejerce su efecto debido a sus implicancias sobre la concentración de O2 disuelto, el pH y la concentración de HCO3- del medio de cultivo. La tensión atmosférica de CO2 y la temperatura del ambiente del cultivo regulan directamente la concentración de CO2 disuelto en el medio de cultivo. Se regulará así de forma indirecta el pH del medio de cultivo, ya que al cultivo se le adiciona también cierta cantidad de HCO3-, con lo cual se establecerá un equilibrio que sirve como tampón:

H20 + CO2 ( H2CO3 ( H+ + HCO3- + Na+ ( NaCO3 + H+

Se ajustan las concentraciones de HCO3- y CO2 para fijar el equilibrio a pH 7,4.

(iii) Medios de cultivo y suplementos.

Con el fin de emular las condiciones in vivo se desarrollaron medios de cultivo basales tales como el de Eagle, y medios más complejos como el 199. Sin embargo estos medios requieren de la suplementación con suero según los tipos celulares. Para condiciones en las cuales es deseable eliminar el suero, se desarrollaron medios de cultivo definidos (de composición conocida) que permiten el correcto crecimiento de un determinado tipo celular in vitro. Cada tipo celular tendrá sus propios requerimientos lo cual hace necesario un cuidadoso análisis de las características del medio de cultivo que se elige para cada tipo celular.

La base de todo medio de cultivo es una solución salina balanceada, a la cual se le van adicionando diferentes componentes para generar un tampón, aminoácidos esenciales, vitaminas, trazas de minerales, y otros metabolitos como piruvato, nucleósidos, lípidos, etc. Como ya hemos comentado, en la mayoría de los casos se adiciona además distintas proporciones de suero, cuyo componente mayoritario son las proteínas tales como transportadores de minerales, hormonas o lípidos (albúmina, globulinas, transferrina, etc). Otros de sus componentes importantes son metabolitos diversos, nutrientes específicos, factores de crecimiento polipeptídicos (PDGF, FGF, NGF, etc.), y hormonas (insulina, hidrocortisona, etc.).

(iv) Propiedades físicas.

La mayoría de las líneas celulares crecen a pH 7,4. Con el fin de fijar el pH del medio de cultivo en este valor, se utiliza un tampón bicarbonato como ya se ha descrito. Este tampón si bien no tiene una alta capacidad, es muy aconsejable debido a su baja toxicidad y a que es el principal sistema de tampón in vivo. Otro factor importante es la osmolaridad, que si bien en el plasma humano es aproximadamente 290 mOsm/kg, en la práctica, en cultivo pueden utilizarse osmolaridades de entre 260 y 320 mOsm/kg para la mayoría de las líneas celulares. La temperatura de incubación de los cultivos se ajusta a la temperatura promedio del animal del cual proviene el cultivo, para mamíferos debe ser de 37ºC, mientras que para otros cultivos de origen diferente como en el caso de insectos o anfibios será distinta. Finalmente, la viscosidad es otra propiedad importante del medio de cultivo, que se encuentra principalmente determinada por los constituyentes del suero.

Dayanis Jiménez , Monografias.com. (s. f.). Técnicas de la Biotecnología (página 2) - Monografias.com. monografías.com. Recuperado 12 de noviembre de 2020, de https://www.monografias.com/trabajos73/tecnicas-biotecnologia/tecnicas-biotecnologia2.shtm